Interferensfaktorer i PCR -reaksjoner

Under PCR -reaksjonen blir det ofte oppstått noen forstyrrende faktorer.
På grunn av den svært høye følsomheten til PCR, anses forurensning for å være en av de viktigste faktorene som påvirker PCR -resultater og kan gi falske positive resultater.
Like kritiske er de forskjellige kildene som fører til falsk-negative resultater. Hvis en eller flere essensielle deler av PCR -blandingen eller selve amplifiseringsreaksjonen blir hemmet eller forstyrret, kan diagnostiske analysen hindres. Dette kan føre til redusert effektivitet og til og med falske negative resultater.
I tillegg til hemming, kan tap av mål nukleinsyreintegritet oppstå på grunn av frakt og/eller lagringsforhold før prøveforberedelse. Spesielt kan høye temperaturer eller utilstrekkelig lagring føre til skade på celler og nukleinsyrer. Celle- og vevsfiksering og parafininnlegging er velkjente årsaker til DNA -fragmentering og et vedvarende problem (se figur 1 og 2). I disse tilfellene vil til og med optimal isolasjon og rensing ikke hjelpe.

Figur 1 | Effekt av immobilisering på DNA -integritet
Agarosegelelektroforese viste at kvaliteten på DNA isolert fra parafinseksjoner av obduksjoner varierte betydelig. DNA med forskjellige gjennomsnittlige fragmentlengder var til stede i ekstraktene avhengig av fikseringsmetoden. DNA ble bare bevart når det ble fikset i innfødte frosne prøver og i bufret nøytralt formalin. Bruken av en sterkt sur bouinfiksativ eller ubuffet, maursyreholdig formalin resulterte i et betydelig tap av DNA. Den gjenværende fraksjonen er svært fragmentert.
Til venstre er lengden på fragmenter uttrykt i kilobase -par (KBP)

Figur 2 | Tap av integritet av nukleinsyremål
(a) Et 3′-5 ′ gap på begge tråder vil resultere i en pause i mål-DNA. Syntese av DNA vil fortsatt forekomme på det lille fragmentet. Imidlertid, hvis et primerglødested mangler på DNA -fragmentet, oppstår bare lineær amplifisering. I det gunstigste tilfellet kan fragmentene gjenopplive hverandre, men utbyttet vil være små og under deteksjonsnivået.
(B) Tap av baser, hovedsakelig på grunn av depurinering og dannelse av tymidindimer, fører til en reduksjon i antall H-bindinger og en reduksjon i TM. I løpet av den langstrakte oppvarmingsfasen vil primerne smelte bort fra matrisen DNA og vil ikke annealet selv under mindre strenge forhold.
(c) Tilstøtende tyminbaser danner en TT -dimer.
Et annet vanlig problem som ofte oppstår i molekylær diagnostikk er den mindre enn optimale frigjøringen av målnukleinsyrer sammenlignet med fenol-kloroformekstraksjon. I ekstreme tilfeller kan dette være assosiert med falske negativer. Mye tid kan lagres ved kokende lysis eller enzymatisk fordøyelse av celleavfall, men denne metoden resulterer ofte i lav PCR -følsomhet på grunn av utilstrekkelig nukleinsyrefrigjøring.

Inhibering av polymeraseaktivitet under amplifisering

Generelt brukes hemming som et beholderkonsept for å beskrive alle faktorer som fører til suboptimale PCR -resultater. I en strengt biokjemisk forstand er hemming begrenset til aktiviteten til enzymet, dvs. det reduserer eller forhindrer underlagsproduktkonvertering gjennom interaksjon med det aktive stedet til DNA-polymerase eller dens kofaktor (f.eks. Mg2+ for TAQ DNA-polymerase).
Komponenter i prøven eller forskjellige buffere og ekstrakter som inneholder reagenser kan direkte hemme enzymet eller felle dens kofaktorer (f.eks. EDTA), og dermed inaktiverer polymerasen og igjen fører til reduserte eller falske negative PCR -resultater.
Imidlertid er mange interaksjoner mellom reaksjonskomponenter og målholdige nukleinsyrer også betegnet som 'PCR-hemmere'. Når cellens integritet blir forstyrret ved isolasjon og nukleinsyren frigjøres, kan interaksjoner mellom prøven og dens omgivende løsning og fast fase oppstå. For eksempel kan 'Scavengers' binde enkelt- eller dobbeltstrenget DNA gjennom ikke-kovalente interaksjoner og forstyrre isolering og rensing ved å redusere antall mål som til slutt når PCR-reaksjonskaret.
Generelt er PCR -hemmere til stede i de fleste kroppsvæsker og reagenser som brukes til kliniske diagnostiske tester (urea i urin, hemoglobin og heparin i blod), kosttilskudd (organiske komponenter, glykogen, fett, Ca2+ ioner) og komponenter i miljøet (fenoler, tunge metaller)

Mer utbredte PCR-hemmere kan finnes i bakterier og eukaryote celler, ikke-mål-DNA, DNA-bindende makromolekyler av vevsmatriser og laboratorieutstyr som hansker og plast. Rensing av nukleinsyrer under eller etter ekstraksjon er den foretrukne metoden for å fjerne PCR -hemmere.
I dag kan forskjellige automatiserte utvinningsutstyr erstatte mange manuelle protokoller, men 100% utvinning og/eller rensing av mål har aldri blitt oppnådd. Potensielle hemmere kan fremdeles være til stede i de rensede nukleinsyrene eller kan allerede ha trådt i kraft. Det finnes forskjellige strategier for å redusere virkningen av hemmere. Valget av passende polymerase kan ha en betydelig innvirkning på hemmeraktiviteten. Andre påviste metoder for å redusere PCR -hemming øker polymerasekonsentrasjonen eller anvendelse av tilsetningsstoffer som BSA.
Inhibering av PCR -reaksjoner kan demonstreres ved bruk av intern prosesskvalitetskontroll (IPC).
Det må utvises forsiktighet for å fjerne alle reagenser og andre løsninger i ekstraksjonssettet, for eksempel etanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol og fenol, fra nukleinsyreisolatet ved et grundig vaskestrinn. Avhengig av konsentrasjonen, kan de aktivere eller hemme PCR.