Interferensfaktorer i PCR-reaksjoner

Under PCR-reaksjonen støter man ofte på noen forstyrrende faktorer.
På grunn av den svært høye sensitiviteten til PCR, anses kontaminering å være en av de viktigste faktorene som påvirker PCR-resultater og kan gi falske positive resultater.
Like kritiske er de ulike kildene som fører til falske negative resultater. Hvis en eller flere essensielle deler av PCR-blandingen eller selve amplifikasjonsreaksjonen hemmes eller forstyrres, kan den diagnostiske analysen hindres. Dette kan føre til redusert effektivitet og til og med falske negative resultater.
I tillegg til inhibering kan tap av målnukleinsyreintegritet oppstå på grunn av forsendelses- og/eller lagringsforhold før prøvepreparering. Spesielt kan høye temperaturer eller utilstrekkelig lagring føre til skade på celler og nukleinsyrer. Celle- og vevsfiksering og parafininnleiring er velkjente årsaker til DNA-fragmentering og et vedvarende problem (se figur 1 og 2). I disse tilfellene vil selv optimal isolasjon og rensing ikke hjelpe.

Figur 1 | Effekt av immobilisering på DNA-integritet
Agarosegelelektroforese viste at kvaliteten på DNA isolert fra parafinsnitt av obduksjoner varierte betydelig. DNA med forskjellige gjennomsnittlige fragmentlengder var tilstede i ekstraktene avhengig av fikseringsmetoden. DNA ble kun bevart når fiksert i native frosne prøver og i bufret nøytralt formalin. Bruken av et sterkt surt Bouin-fiksativ eller ubufret, maursyreholdig formalin resulterte i et betydelig tap av DNA. Den gjenværende fraksjonen er svært fragmentert.
Til venstre er lengden på fragmentene uttrykt i kilobasepar (kbp)

Figur 2 | Tap av integritet til nukleinsyremål
(a) Et 3′-5′ gap på begge trådene vil resultere i et brudd i mål-DNA. syntese av DNA vil fortsatt forekomme på det lille fragmentet. Imidlertid, hvis et primer-annealingssted mangler på DNA-fragmentet, skjer bare lineær amplifikasjon. I det gunstigste tilfellet kan fragmentene gjenmette hverandre, men utbyttene vil være små og under deteksjonsnivåer.
(b) Tap av baser, hovedsakelig på grunn av depurinering og tymidin-dimerdannelse, fører til en reduksjon i antall H-bindinger og en reduksjon i Tm. Under den forlengede oppvarmingsfasen vil primerne smelte bort fra matriks-DNA og vil ikke anneale selv under mindre stringente forhold.
(c) Tilstøtende tyminbaser danner en TT-dimer.
Et annet vanlig problem som ofte oppstår i molekylær diagnostikk er den mindre enn optimal frigjøring av målnukleinsyrer sammenlignet med fenol-kloroform-ekstraksjon. I ekstreme tilfeller kan dette være forbundet med falske negativer. Mye tid kan spares ved kokende lysis eller enzymatisk fordøyelse av celleavfall, men denne metoden resulterer ofte i lav PCR-følsomhet på grunn av utilstrekkelig frigjøring av nukleinsyre.

Hemming av polymeraseaktivitet under amplifikasjon

Generelt brukes hemming som et beholderkonsept for å beskrive alle faktorer som fører til suboptimale PCR-resultater. I strengt biokjemisk forstand er inhibering begrenset til aktiviteten til enzymet, dvs. den reduserer eller forhindrer substrat-produktomdannelse gjennom interaksjon med det aktive stedet til DNA-polymerasen eller dens kofaktor (f.eks. Mg2+ for Taq DNA-polymerase).
Komponenter i prøven eller ulike buffere og ekstrakter som inneholder reagenser kan direkte hemme enzymet eller fange dets kofaktorer (f.eks. EDTA), og dermed inaktivere polymerasen og igjen føre til reduserte eller falske negative PCR-resultater.
Imidlertid er mange interaksjoner mellom reaksjonskomponenter og målholdige nukleinsyrer også betegnet som 'PCR-hemmere'. Når integriteten til cellen er forstyrret av isolasjon og nukleinsyren frigjøres, kan interaksjoner mellom prøven og dens omkringliggende løsning og fast fase oppstå. For eksempel kan "scavengers" binde enkelt- eller dobbelttrådet DNA gjennom ikke-kovalente interaksjoner og forstyrre isolasjon og rensing ved å redusere antall mål som til slutt når PCR-reaksjonskaret.
Generelt er PCR-hemmere tilstede i de fleste kroppsvæsker og reagenser som brukes til kliniske diagnostiske tester (urea i urin, hemoglobin og heparin i blod), kosttilskudd (organiske komponenter, glykogen, fett, Ca2+ ioner) og komponenter i miljøet (fenoler). , tungmetaller)

Mer utbredte PCR-hemmere kan finnes i bakterier og eukaryote celler, ikke-mål-DNA, DNA-bindende makromolekyler av vevsmatriser og laboratorieutstyr som hansker og plast. Rensing av nukleinsyrer under eller etter ekstraksjon er den foretrukne metoden for å fjerne PCR-hemmere.
I dag kan ulikt automatisert ekstraksjonsutstyr erstatte mange manuelle protokoller, men 100 % gjenvinning og/eller rensing av mål har aldri blitt oppnådd. Potensielle inhibitorer kan fortsatt være tilstede i de rensede nukleinsyrene eller kan allerede ha fått effekt. Det finnes ulike strategier for å redusere virkningen av inhibitorer. Valget av passende polymerase kan ha en betydelig innvirkning på inhibitoraktivitet. Andre utprøvde metoder for å redusere PCR-hemming er å øke polymerasekonsentrasjonen eller bruke tilsetningsstoffer som BSA.
Hemming av PCR-reaksjoner kan påvises ved bruk av intern prosesskvalitetskontroll (IPC).
Det må utvises forsiktighet for å fjerne alle reagenser og andre løsninger i ekstraksjonssettet, slik som etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol og fenol, fra nukleinsyreisolatet ved et grundig vasketrinn. Avhengig av konsentrasjonen kan de aktivere eller hemme PCR.