Utførelse av fire nukleinsyreamplifiseringsanalyser for å identifisere SARS-CoV-2 i Etiopia

Takk for at du besøker Nature.com. Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viser en karusell med tre lysbilder samtidig. Bruk Forrige- og Neste-knappene for å gå gjennom tre lysbilder om gangen, eller bruk glidebryterknappene på slutten for å gå gjennom tre lysbilder om gangen.
Siden utbruddet av koronavirussykdommen (COVID-19) i 2019 har mange kommersielle nukleinsyreamplifiseringstester (NAAT-er) blitt utviklet over hele verden og har blitt standardanalyser. Selv om flere tester raskt ble utviklet og brukt i laboratoriediagnostiske tester, har ytelsen til disse testene ikke blitt evaluert i en rekke forskjellige settinger. Derfor hadde denne studien som mål å evaluere ytelsen til Abbott SARS-CoV-2-, Daan Gene-, BGI- og Sansure Biotech-analysene ved hjelp av Composite Reference Standard (CRS). Studien ble utført ved Ethiopian Public Health Institute (EPHI) fra 1. til 30. desember 2020. 164 nasofaryngeale prøver ble ekstrahert ved hjelp av QIAamp RNA mini-kit og Abbott DNA-prøveprepareringssystem. Av 164 prøver var 59,1 % positive og 40,9 % var negative for CRS. Sansure Biotech-positiviteten var signifikant lav sammenlignet med CRS (p < 0,05). Sansure Biotech-positiviteten var signifikant lav sammenlignet med CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotechs positive resultater var betydelig lavere sammenlignet med CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）.与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）. У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech hadde signifikant færre positive resultater sammenlignet med CRS (p < 0,05).Den totale samsvarsraten for de fire analysene var 96,3–100 % sammenlignet med CRS. I tillegg til den lave positivitetsraten for Sansure Biotech-analysen, var ytelsen til de fire analysene nesten sammenlignbar. Som sådan krever Sansure Biotech [Research Only (RUO)]-analysen ytterligere validering for bruk i Etiopia. Til slutt bør ytterligere forskning vurderes for å evaluere analyser med passende produsentpåstander.
Laboratorietesting er en del av Verdens helseorganisasjons (WHO) strategiske plan for beredskap og respons på koronavirussykdom 2019 (COVID-19) (SPRP). WHO anbefaler at land må bygge laboratoriekapasitet for å forbedre beredskap, forsvarlig saksbehandling, årvåkenhet og rask respons på folkehelseutfordringer. Dette antyder at laboratoriets rolle er nøkkelen til å karakterisere sykdommen og epidemiologien til nye smittestoffer og kontrollere spredningen deres.
Diagnosen COVID-19 krever epidemiologisk og medisinsk informasjon, personlige symptomer/tegn og radiografiske og laboratoriedata2. Siden COVID-19-utbruddet ble rapportert i Wuhan, Kina, har mange kommersielle nukleinsyreamplifiseringstester (NAAT-er) blitt utviklet over hele verden. Realtids revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (rRT-PCR) har blitt brukt som en rutinemessig og standard metode for laboratoriediagnose av alvorlig akutt respiratorisk syndrom 2 (SARS-CoV-2)3-infeksjon. Molekylær deteksjon av SARS-CoV-2 er vanligvis basert på N- (nukleokapsidproteingen), E- (konvoluttproteingen) og RdRp- (RNA-avhengig RNA-polymerasegen)-genene i ORF1a/b-regionen (åpen leseramme 1a/b-gen) identifisert fra virusgenet. De anses å være de viktigste konserverte regionene som finnes i virusgenomer for virusgjenkjenning4. Blant disse genene har RdRp- og E-genene høy analytisk deteksjonsfølsomhet, mens N-genet har lav analytisk følsomhet5.
Ytelsen til PCR-analyser kan variere avhengig av ulike faktorer som: ekstraksjonsreagenser, amplifiserings-/deteksjonsreagenser, ekstraksjonsmetode, kvaliteten på PCR-maskinen og andre instrumenter. Per april 2020 har mer enn 48 forskjellige diagnostiske enheter fra ni land mottatt nødbrukstillatelse (EUA) for COVID-196-diagnostikk. I Etiopia brukes mer enn 14 sanntids-PCR-plattformer for PCR-deteksjon av SARS-CoV-2 ved 26 offentlige helseinstitusjoner, inkludert ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 og Quant-studio7. I tillegg er ulike PCR-testsett tilgjengelige, som Daan Gene-testen, Abbott SARS-CoV-2-testen, Sansure Biotech-testen og SARS-CoV-2 BGI-testen. Selv om rRT-PCR er svært sensitiv, rapporterer noen pasienter med COVID-19 falske negative resultater på grunn av utilstrekkelige kopier av viral ribonukleinsyre (RNA) i prøver på grunn av feil innsamling, transport, lagring og håndtering, og laboratorietesting. forhold og handlinger fra personell8. I tillegg kan feilhåndtering av prøver eller kontroller, innstilling av syklusterskel (Ct) og kryssreaktivitet med andre patogene nukleinsyrer eller inaktivt/resterende SARS-CoV-2 RNA føre til falskt positive resultater i rRT-PCR9-analyser. Det er derfor klart at PCR-tester faktisk kan identifisere bærere av genfragmenter, ettersom de ikke engang kan skille mellom virkelig aktive virusgener, så testene kan bare identifisere bærere og ikke pasienter10. Derfor er det viktig å vurdere diagnostisk ytelse ved hjelp av standardmetoder i vår setting. Selv om mange NAAT-reagenser er tilgjengelige ved Ethiopian Public Health Institute (EPHI) og over hele landet, er det ennå ikke rapportert noen sammenlignende evaluering av deres effektivitet. Derfor hadde denne studien som mål å evaluere den sammenlignende ytelsen til kommersielt tilgjengelige sett for påvisning av SARS-CoV-2 ved rRT-PCR ved bruk av kliniske prøver.
Totalt 164 deltakere med mistenkt COVID-19 ble inkludert i denne studien. Majoriteten av prøvene var fra behandlingssentre (118/164 = 72 %), mens de resterende 46 (28 %) deltakerne var fra ikke-behandlingssentre. Blant deltakerne som ikke ble behandlet ved senteret, hadde 15 (9,1 %) klinisk mistenkte tilfeller og 31 (18,9 %) hadde kontakt med bekreftede tilfeller. Nittitre (56,7 %) deltakere var menn, og gjennomsnittsalderen (± SD) for deltakerne var 31,10 (± 11,82) år.
I denne studien ble positive og negative rater for fire COVID-19-tester bestemt. Dermed var de positive ratene for Abbott SARS-CoV-2-analysen, Daan Gene 2019-nCoV-analysen, SARS-CoV-2 BGI-analysen og Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen henholdsvis 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % og 55,5 %. De positive og negative sammensatte referansestandard-skårene (CRS) var henholdsvis 97 (59,1 %) og 67 (40,9 %) (tabell 1). I denne studien var definisjonen av CRS basert på «enhver positiv»-regelen, der to eller flere testresultater som ga samme resultat ble ansett som sanne positive eller negative av fire testresultater.
I denne studien fant vi en negativ prosentvis samsvar (NPA) på 100 % (95 % KI 94,6–100) for alle analyser sammenlignet med CRS. Sansure Biotechnology-analysen viste en minimal PPA på 93,8 % (95 % KI 87,2–97,1), og Daan Gene 2019-nCoV-analysen hadde en samlet samsvar på 99,4 % (95 % KI 96,6–99,9). I motsetning til dette var den samlede samsvaren mellom SARS-CoV-2 BGI-analysen og Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen henholdsvis 98,8 % og 96,3 % (tabell 2).
Cohens kappa-koeffisient for samsvar mellom CRS og Abbott SARS-CoV-2-analyseresultatene var helt konsistent (K = 1,00). Tilsvarende er Cohens kappa-verdier påvist av Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI og Sansure Biotech 2019-nCoV også helt konsistente med CRS (K ≥ 0,925). I denne sammenlignende analysen viste kji-kvadrat-testen (McNemar-testen) at Sansure Biotech 2019-nCoV-analyseresultatene var signifikant forskjellige fra CRS-resultatene (p = 0,031) (tabell 2).
Som vist i fig.1 prosentandelen av laveste Ct-verdi (< 20 Ct) i Abbott SARS-CoV-2-analysen (kombinert RdRp- og N-gen) var 87,6 %, og ORF1a/b-genets Ct-verdi i Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen viste at prosentandelen av lav Ct-verdi (< 20 Ct) var 50,3 % og den høye Ct-verdien (36–40 Ct) var 3,2 %. 1 prosentandelen av laveste Ct-verdi (< 20 Ct) i Abbott SARS-CoV-2-analysen (kombinert RdRp- og N-gen) var 87,6 %, og ORF1a/b-genets Ct-verdi i Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen viste at prosentandelen av lav Ct-verdi (< 20 Ct) var 50,3 % og den høye Ct-verdien (36–40 Ct) var 3,2 %.Som vist i fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6 Ct Ot 1%, г. анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3 %, а высокое значения (36 Ct) – 36 Ct. составляло 3,2 %. 1, prosentandelen av den laveste Ct-verdianalysen (< 20 Ct) av Abbott SARS-CoV-2 (kombinert gen RdRp og N) var 87,6 %, og Ct-verdien av ORF1a/b-genanalysen av Sansure Biotech 2019-nCoV viste at prosentandelen av lav Ct-verdi (< 20 Ct) utgjorde 50,3 %, og høy Ct-verdi (36–40 Ct) utgjorde 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比三（（< 20% Ct. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值Ct(36)的百分比为3,2 %. Som vist i figur 1 er den laveste Ct-verdiprosenten (< 20 Ct) for Abbott SARS-CoV-2-testen (kombinasjon av RdRp og N-genet) 87,6 %, ORF1a/b-genets Ct-verdi for Sansure Biotech 2019-nCoV-testen viser en lav Ct-prosent (< 20 Ct) på 50,3 %, og en Ct-prosent (36–40 Ct) på 3,2 %. Hva er tilfellet for рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное в сентное (2 Ctчентое) размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Som vist i figur 1 hadde Abbott SARS-CoV-2-analysen (som kombinerer RdRp- og N-genene) den laveste prosentvise Ct-verdien (< 20 Ct) på 87,6 %, mens Ct-verdien til ORF1a/b-genet i Sansure Biotech 2019-studien – Analysen av nCoV viste en lav Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3 %, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2 %. Prosentandelen av verdier (< 20 Ct) var 50,3 %, og prosentandelen av høye Ct-verdier (36–40 Ct) var 3,2 %.Abbott SARS-CoV-2 B-testen registrerte Ct-verdier over 30. På den annen side hadde ORF1a/b-genet en høy Ct-verdi (> 36 Ct) i BGI SARS-CoV-2-analysen, og prosentandelen var 4 % (fig. 1). På den annen side hadde ORF1a/b-genet en høy Ct-verdi (> 36 Ct) i BGI SARS-CoV-2-analysen, og prosentandelen var 4 % (fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого состали 1 (рисокое значение). På den annen side hadde ORF1a/b-genet i analysen av BGI SARS-CoV-2 en høy Ct-verdi (> 36 Ct), hvorav prosentandelen var 4 % (fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分毼为分毼为 På den annen side, i BGI SARS-CoV-2-deteksjon, er prosentandelen av ORF1a/b-genet med høy Ct-verdi (>36 Ct) 4 % (figur 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис.). På den annen side var prosentandelen ORF1a/b-gener med høye Ct-verdier (>36 Ct) i BGI SARS-CoV-2-analysen 4 % (fig. 1).
I denne studien tok vi 164 nasofaryngeale prøver. For alle typer analyser ble RNA-isolering og -amplifisering utført ved hjelp av metodene og settene som ble anbefalt av de respektive produsentene.
Denne studien viste at Abbotts test for SARS-CoV-2 har samme deteksjonsytelse som CRS, med 100 % positiv, negativ og generell samsvar. Cohens kappa-samsvar er 1,00, noe som indikerer full samsvar med CRS. En lignende studie fra University of Washington i USA fant at den generelle sensitiviteten og spesifisiteten til Abbott-testen for SARS-CoV-2 var henholdsvis 93 % og 100 %, sammenlignet med CDCs laboratoriebestemte analyse (LDA). 11. Abbotts SARS-CoV-2-deteksjonssystem er basert på samtidig kombinert deteksjon av N- og RdRp-genene, ettersom begge genene er mer følsomme, noe som minimerer falske negative resultater12. En studie i Wien, Østerrike, viste også at store ekstraksjonsprøvevolumer og deteksjonseluentvolumer minimerte fortynningseffekter og økte deteksjonseffektiviteten13. Dermed kan Abbotts perfekte match for SARS-CoV-2-analysen assosieres med et plattformdeteksjonssystem som samtidig oppdager kombinatoriske gener, ekstraherer et stort antall prøver (0,5 ml) og bruker en stor mengde eluent (40 µl).
Resultatene våre viste også at deteksjonsytelsen til Daan-gentesten var nesten den samme som for CRS. Dette er i samsvar med en studie14 utført ved Anhui University i Huainan, Kina, og produsentens påstand om 100 % positiv samsvar. Til tross for rapporter om konsistente resultater, var én prøve falsk negativ etter ny testing av samme eluat, men var positiv i Abbott SARS-CoV-2- og Sansure Biotech nCoV-2019-analysene. Dette tyder på at det kan være variasjon i resultatene på tvers av ulike typer analyser. Likevel var resultatet av Daan Gene-analysen i studien som ble utført i Kina15 signifikant forskjellig (p < 0,05) sammenlignet med deres laboratoriedefinerte referanseanalyse. Likevel var resultatet av Daan Gene-analysen i studien som ble utført i Kina15 signifikant forskjellig (p < 0,05) sammenlignet med deres laboratoriedefinerte referanseanalyse. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) эталонного анализа. I en studie i Kina15 var imidlertid Daan Genes analyseresultat signifikant forskjellig (p < 0,05) fra deres referanseanalyse i laboratoriet.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались в поюсра (p < 0,0сра) его эталонным лабораторным тестом. I en studie i Kina15 var imidlertid resultatene av Daans genetiske test signifikant forskjellige (p < 0,05) sammenlignet med referansetesten i laboratoriet.Denne avviken kan skyldes referansetestens følsomhet for å oppdage SARS-CoV-2, og videre studier kan være viktige for å bestemme årsaken.
I tillegg evaluerte studien vår den komparative ytelsen til SARS-CoV-2 BGI-analysen med CRS, og viste utmerket positiv prosentvis samsvar (PPA = 97,9 %), negativ prosentvis samsvar (NPA = 100 %) og total prosentvis samsvar etter kjønn (OPA). = 98,8 %). Cohens Kappa-verdier viste god samsvar (K = 0,975). Studier i Nederland16 og Kina15 har vist konsistente resultater. SARS-CoV-2 BGI-testen er en enkeltgen-deteksjonstest (ORF1a/b) som bruker 10 µl amplifiserings-/deteksjonseluat. Til tross for god statistisk samsvar med våre referanseresultater, bommet analysen på to positive prøver (1,22 %) av den totale prøven. Dette kan ha store kliniske implikasjoner for overføringsdynamikk både på pasient- og samfunnsnivå.
En annen sammenlignende analyse som ble inkludert i denne studien var Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO)-analysen; den totale samsvarsprosenten var 96,3 %. Samsvarsstyrken ble også bestemt av Cohens Kappa-verdi, som var 0,925, noe som indikerer full samsvar med CRS. Igjen er resultatene våre identiske med studier utført ved Central South University i Changsha, Kina, og ved Clinical Laboratory Department of Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, Kina17. Selv om den ovennevnte gode statistiske samsvaren ble registrert, viste kji-kvadrat-testen (MacNemar-testen) at resultatet av Sansure Biotech-analysen hadde en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med CRS (p < 0,005). Selv om den ovennevnte gode statistiske samsvaren ble registrert, viste kji-kvadrat-testen (MacNemar-testen) at resultatet av Sansure Biotech-analysen hadde en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критеритерикхий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие på сравнению с CRS (p5 <). Selv om den gode statistiske samsvaren ovenfor ble registrert, viste kji-kvadrat-testen (McNemar-testen) at resultatet av Sansure Biotech-analysen hadde en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）桨明，Sansure 看看明，Sansure Biotech相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 桨明 , san tech ，与 crs 相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。〼。。。。。。。。〉 Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макрамакне) статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech og CRS. Til tross for den gode statistiske samsvaren som er nevnt ovenfor, viste kji-kvadrat-testen (McNemar-testen) en statistisk signifikant forskjell (p < 0,005) mellom Sansure Biotech-analysen og CRS.Seks prøver (3,66 %) viste seg å være falskt negative sammenlignet med CRS (tilleggstabell 1); dette er svært viktig, spesielt gitt dynamikken i virusets overføring. Dataene ovenfor støtter også denne lave deteksjonsraten15.
I denne studien ble Ct-verdier bestemt for hver analyse og respektive plattform, med den laveste gjennomsnittlige Ct-verdien rapportert i Abbott SARS-CoV-2-analysen. Dette resultatet kan være relatert til Abbotts samtidige kombinerte genetiske testsystem for påvisning av SARS-CoV-2. Derfor, ifølge figur 1, hadde 87,6 % av Abbott SARS-CoV-2-resultatene Ct-verdier under 20. Bare et lite antall prøveresultater (12,4 %) var i området 20–30. Ct-verdier over 30 ble ikke registrert. I tillegg til Abbotts bruk av SARS-CoV-2-panelets genetiske testformat, kan dette resultatet være relatert til den nedre deteksjonsgrensen (32,5 RNA-kopier/ml)18, som er tre ganger lavere enn selskapets nedre grense på 100 RNA-kopier/ml)19.
Denne studien har noen begrensninger: for det første har vi ikke standard-/referansemetoder [som virusmengde eller andre laboratorietester (LDA)] på grunn av mangel på ressurser. For det andre var alle prøvene som ble brukt i denne studien nasofaryngeale vattpinner, mens resultatene ikke var anvendelige for andre prøvetyper, og for det tredje var utvalgsstørrelsen vår liten.
Denne studien sammenlignet ytelsen til fire rRT-PCR-analyser for SARS-CoV-2 ved bruk av nasofaryngeale prøver. Alle deteksjonsanalysene hadde nesten sammenlignbar ytelse, med unntak av Sansure Biotech-analysen. Dessuten ble den lave positivitetsraten identifisert i Sansure Biotech-analysen sammenlignet med CRS (p < 0,05). Dessuten ble den lave positivitetsraten identifisert i Sansure Biotech-analysen sammenlignet med CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). I tillegg viste Sansure Biotech-testen en lav prosentandel av positive resultater sammenlignet med CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). I tillegg hadde Sansure Biotech-analysen en lavere positivitetsrate sammenlignet med CRS (p < 0,05).Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-analysen av PPA, NPA og total samsvar oversteg 93,5 % med en Cohen Kappa-styrkeverdi på 0,925. Til slutt trenger Sansure Biotech Assay (RUO) ytterligere validering for bruk i Etiopia, og ytterligere forskning bør vurderes for å evaluere påstander fra individuelle produsenter.
En sammenlignende studiedesign ble utført ved fire helseinstitusjoner i Addis Abeba: Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial Hospital og St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. Dataene ble samlet inn mellom 1. og 31. desember 2020. De medisinske fasilitetene for denne studien ble målrettet valgt basert på det høye antallet tilfeller og tilgjengeligheten av store behandlingssentre i byen. Instrumenter, inkludert ABI 7500 og Abbott m2000 sanntids-PCR-instrumenter, ble valgt i henhold til anbefalingene fra NAAT-reagensprodusentene, og fire PCR-deteksjonssett ble valgt for denne studien, ettersom de fleste laboratorier i Etiopia brukte minst fire av dem. Gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test og SARS-CoV-2 BGI-test utført under studien.
Testing for SARS-CoV-2 ble utført fra 1. til 30. desember 2020 ved bruk av 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) fra individer som ble undersøkt for COVID-19 og henvist til EPHI. Nasofaryngeale prøver ble samlet inn av trente prøvetakere og sendt til EPHI i trippelpakninger. Før isolering av nukleinsyre tildeles hver prøve et unikt identifikasjonsnummer. Ekstraksjon utføres fra hver prøve umiddelbart ved ankomst ved hjelp av manuelle og automatiske ekstraksjonsmetoder. For automatisk ekstraksjon av Abbott m2000 ble derfor 1,3 ml (inkludert 0,8 ml dødvolum og 0,5 ml ekstraksjonsinnløpsvolum) av prøven ekstrahert fra hver prøve og ført gjennom Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) En batch på 96 [92 prøver, to deteksjonskontroller og to ikke-malkontroller (NTC)] ble inkludert i den totale prosessen (henting og deteksjon) av to runder med SARS-CoV-2 (EUA) i sanntid. Bruk på samme måte de samme prøvene (for automatisk ekstraksjon og oppdagelse) for manuell ekstraksjon. Gjennom hele prosessen ble derfor 140 µl prøver alikvotert og ekstrahert ved hjelp av QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland) i batcher på 24 (inkludert 20 prøver, to analysekontroller og to NTC-er) over ni runder. Manuelt ekstraherte eluater ble amplifisert og detektert ved hjelp av en ABI 7500 termisk sykler som brukte SARS-CoV-2 BGI-analyse, Daan Gene-analyse og Sansure Biotech-analyse.
Automatisert isolering og rensing av SARS-CoV-2 viralt RNA følger prinsippet om magnetiske kuler ved bruk av Abbott DNA-prøveprepareringsreagenser. Inaktivering av prøver og oppløselighet av viruspartikler utføres ved bruk av et vaskemiddel som inneholder guanidinisotiocyanat for å denaturere proteinet og inaktivere RNase. RNA separeres deretter fra proteinet ved fastfaseseparasjon ved bruk av silika, dvs. guanidiniumsaltet, og den alkaliske pH-verdien i lysisbufferen fremmer binding av nukleinsyrene til silikaen (SiO2). Skylletrinnet fjerner gjenværende proteiner og rusk for å produsere en klar løsning. Transparent RNA isoleres fra silikabaserte mikropartikler ved bruk av instrumentets magnetfelt20,21. På den annen side utføres manuell isolering og rensing av RNA ved hjelp av spinnkolonnemetoden ved bruk av sentrifugering i stedet for et magnetisk stativ og separasjon av mikropartikler fra elueringsmiddelet.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner, som mottok EUA19,22 fra WHO og FDA. I denne protokollen ble prøveinaktivering før ekstraksjon utført i et vannbad ved 56 °C i 30 minutter. Etter virusinaktivering ble nukleinsyreekstraksjon utført på et Abbott m2000 SP-instrument fra 0,5 ml VTM ved bruk av et Abbott m2000 DNA-prøveprepareringssystem, i henhold til produsenten. Amplifisering og deteksjon ble utført ved bruk av et Abbott m2000 RT-PCR-instrument, og dobbel deteksjon ble utført for RdRp- og N-genene. ROX) og VIC P (proprietært fargestoff) for målretting og deteksjon av interne kontroller, noe som muliggjør samtidig deteksjon av begge amplifiseringsproduktene 19.
Amplifikasjonsdeteksjonsmetoden i dette settet er basert på ett-trinns RT-PCR-teknologi. ORF1a/b- og N-genene ble valgt som konserverte regioner av Daan Gene Technology for å detektere amplifisering av målregionen. Spesifikke primere og fluorescerende prober (N-genprober merket med FAM, ORF1a/b-prober merket med VIC) er utviklet for å detektere SARS-CoV-2 RNA i prøver. Den endelige eluenten og masterblandingen ble fremstilt ved å tilsette 5 µl eluent til 20 µl av masterblandingen til et sluttvolum på 25 µl. Amplifikasjon og deteksjon ble utført samtidig på et ABI 750024 sanntids-PCR-instrument.
ORF1a/b- og N-genene ble detektert ved hjelp av Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluorescerende PCR-deteksjon). Forbered spesifikke prober for hvert målgen ved å velge FAM-kanalen for ORF1a/b-regionen og ROX-kanalen for N-genet. Til dette analysesettet tilsettes eluent og mastermix-reagenser som følger: forbered 30 µl mastermix-reagens og 20 µl eluert prøve for deteksjon/amplifikasjon. Realtids-PCR ABI 750025 ble brukt til amplifikasjon/deteksjon.
SARS-CoV-2 BGI-testen er et fluorescerende sanntids-rRT-PCR-sett for diagnostisering av COVID-19. Målregionen er lokalisert i ORF1a/b-regionen av SARS-CoV-2-genomet, som er en metode for deteksjon av ett enkelt gen. I tillegg er det humane husholdningsgenet β-aktin et internt regulert målgen. Masterblandingen fremstilles ved å blande 20 µl av masterblandingsreagenset og 10 µl av den ekstraherte RNA-prøven i en brønnplate26. Et ABI 7500 fluorescerende kvantitativt sanntids-PCR-instrument ble brukt til amplifisering og deteksjon. All nukleinsyreamplifisering, PCR-kjørebetingelser for hver analyse og tolkning av resultatene ble utført i henhold til den respektive produsentens instruksjoner (tabell 3).
I denne sammenlignende analysen brukte vi ikke referansestandardmetoden for å bestemme prosentvis samsvar (positiv, negativ og total) og andre sammenligningsparametere for de fire analysene. Hver testsammenligning ble gjort med CRS. I denne studien ble CRS satt av regelen «enhver positiv», og resultatet ble bestemt. Vi brukte ikke bare én test. I tillegg er falske negative resultater farligere enn falske positive resultater ved COVID-19-smitte. For å si «positiv» så nøyaktig som mulig fra et CRS-resultat, må derfor minst to analysetester være positive. Dette betyr at minst ett positivt resultat sannsynligvis kommer fra en EUA-analyse. Av fire testresultater anses to eller flere testresultater som gir samme resultat som sanne positive eller negative18,27.
Data ble samlet inn ved hjelp av strukturerte datauttrekkingsskjemaer, dataregistrering og analyse ble utført ved hjelp av statistisk programvare i Excel og SPSS versjon 23.0 for beskrivende statistikk. Positiv, negativ og total prosentvis samsvar ble analysert, og en Kappa-score ble brukt til å bestemme graden av samsvar for hver metode med CRS. Kappa-verdier tolkes som følger: 0,01 til 0,20 for mild samsvar, 0,21 til 0,40 for generell samsvar, 0,41–0,60 for moderat samsvar, 0,61–0,80 for vesentlig samsvar og 0,81–0,99 for fullstendig samsvar.28
Etisk godkjenning ble innhentet fra Universitetet i Addis Abeba, og alle eksperimentelle protokoller for denne studien ble godkjent av Det etiopiske folkehelseinstituttets vitenskapelige etikkvurderingsnemnd. Referansenummeret for EPHIs etikklisens er EPHI/IRB-279-2020. Alle metoder ble anvendt i samsvar med anbefalingene og bestemmelsene i de etiopiske nasjonale omfattende retningslinjene for behandling av COVID-19. I tillegg ble skriftlig informert samtykke innhentet fra alle studiedeltakere før deltakelse i studien.
Alle data som er innhentet eller analysert i denne studien er inkludert i denne publiserte artikkelen. Data som støtter resultatene av denne studien er tilgjengelig fra den respektive forfatteren på rimelig forespørsel.
Verdens helseorganisasjon. Anbefalinger for laboratorieteststrategier for COVID-19: Midlertidig veiledning, 21. mars 2020 nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. og Gourgoulianis, KI. Smart COVID-19-diagnose på akuttmottaket: Alt i praksis. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. og Gourgoulianis, KI. Smart COVID-19-diagnose på akuttmottaket: Alt i praksis.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. og Gurgulianis, KI Intelligent diagnostisering av COVID-19 på akuttmottaket: alt i praksis.Muliou DS, Pantazopoulos I. og Gurgulyanis KI Intelligent diagnostisering av COVID-19 på akuttmottak: ende-til-ende-integrasjon i praksis. Expert Reverend Respire. medicine. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL og St George, K. Evaluering av COVID19 ID NOW EUA-analysen. Mitchell, SL og St George, K. Evaluering av COVID19 ID NOW EUA-analysen.Mitchell, SL og St. George, K. Evaluering av COVID19 ID NOW EUA-analysen.Mitchell SL og St. George K. Evaluering av COVID19 ID NOW EUA-analysen. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratoriepåvisning av koronavirussykdom 2019 (COVID-19) ved mistenkt sykdom hos mennesker. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (besøkt 15. august 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al. COVID-19-diagnose: Sykdommer og testverktøy. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Etablering av Patologkollegiet i Øst-, Sentral- og Sør-Afrika – Regional School of Pathology of the Middle East and South Africa. Afrika. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopisk institutt for folkehelse, Det føderale helsedepartementet. Midlertidig nasjonal strategi og veiledning for laboratoriediagnose av COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (besøkt 12. august 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. og Kesselheim, AS. Falske negative tester for SARS-CoV-2-infeksjon – utfordringer og implikasjoner. Woloshin, S., Patel, N. og Kesselheim, AS. Falske negative tester for SARS-CoV-2-infeksjon – utfordringer og implikasjoner.Voloshin S., Patel N. og Kesselheim AS Falskt negative tester for SARS-CoV-2-infeksjoner og konsekvensene av disse.Voloshin S., Patel N. og Kesselheim AS Falskt negative tester for provokasjon og virkningen av SARS-CoV-2-infeksjon. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS og Gourgoulianis, KI Falskt positive og falskt negative COVID-19-tilfeller: Strategier for forebygging og behandling av respiratoriske systemer, vaksinasjon og ytterligere perspektiver. Mouliou, DS og Gourgoulianis, KI Falskt positive og falskt negative COVID-19-tilfeller: Strategier for forebygging og behandling av respiratoriske systemer, vaksinasjon og ytterligere perspektiver. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI. вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS og Gourgoulianis, KI Falske positive og falske negative tilfeller av COVID-19: strategier for forebygging og behandling av luftveiene, vaksinasjon og veien videre.Muliu, DS og Gurgulianis, KI Falskt positive og falskt negative tilfeller av COVID-19: strategier for forebygging og behandling av respiratoriske sykdommer, vaksinasjon og veien videre. Expert Reverend Respire. medicine. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. og Konstantinos, G. COVID-19-diagnose på akuttmottaket: Å se treet, men miste skogen. Mouliou, DS, Ioannis, P. og Konstantinos, G. COVID-19-diagnose på akuttmottaket: Å se treet, men miste skogen.Mouliou, DS, Ioannis, P. og Konstantinos, G. COVID-19-diagnose på akuttmottaket: Se treet, mist skogen.Muliou DS, Ioannis P., og Konstantinos G. COVID-19-diagnose på akuttmottak: Ikke nok skog for trærne. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validering og validering av den analytiske og kliniske ytelsen til Abbott RealTime SARS-CoV-2-analysen. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. og Aflatoonian, B. Sammenligning av fem primersett fra forskjellige genomregioner av COVID-19 for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. og Aflatoonian, B. Sammenligning av fem primersett fra forskjellige genomregioner av COVID-19 for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. og Aflatunyan, B. Sammenligning av fem sett med primere fra forskjellige regioner av COVID-19-genomet for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. og Aflatoonian, B. Sammenligning av 5 forskjellige genetiske regioner av COVID-19 for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. og Aflatunyan B. Sammenligning av fem sett med primere fra forskjellige regioner av COVID-19-genomet for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR.Iran. J. Mikrobiologi. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Foreløpige resultater fra det nasjonale eksterne kvalitetsvurderingsprogrammet for påvisning av SARS-CoV-2-genomsekvenser. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Analytisk evaluering av effekten av fem RT-PCR-sett for alvorlig akutt respiratorisk syndrom koronavirus 2. J. Clinical. laboratory. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Evaluering av sju kommersielt tilgjengelige SARS-CoV-2 RNA-deteksjonssett i Kina basert på sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR). klinisk. Kjemisk. laboratorium. medisin. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Sammenligning av sju kommersielle RT-PCR COVID-19-diagnostiske sett. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu mfl. Sammenligning av diagnostisk ytelse av to PCR-sett for påvisning av SARS-CoV-2-nukleinsyrer. J. Clinical. laboratory. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. En sammenlignende studie av fire SARS-CoV-2 nukleinsyreamplifiseringstesting (NAAT)-plattformer viste at ID NOW-ytelsen ble betydelig forringet avhengig av pasient og prøvetype. diagnose. mikrobiologi. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbott-molekyl. Pakningsvedlegg for sanntidsanalyse av SARS-CoV-2 fra Abbott. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Per 10. august 2020) (2020).
Klein, S. et al. SARS-CoV-2 RNA-isolering ved bruk av magnetiske kuler for rask storskala deteksjon med RT-qPCR og RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).