Utførelse av fire nukleinsyreamplifikasjonsanalyser for å identifisere SARS-CoV-2 i Etiopia

Takk for at du besøker Nature.com. Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte. For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viser en karusell med tre lysbilder samtidig. Bruk Forrige og Neste-knappene for å gå gjennom tre lysbilder om gangen, eller bruk skyveknappene på slutten for å gå gjennom tre lysbilder om gangen.
Siden utbruddet av koronavirussykdommen (COVID-19) i 2019 har mange kommersielle nukleinsyreamplifikasjonstester (NAAT) blitt utviklet rundt om i verden og har blitt standardanalyser. Selv om flere tester raskt ble utviklet og brukt på laboratoriediagnostiske tester, har ikke ytelsen til disse testene blitt evaluert i en rekke settinger. Derfor hadde denne studien som mål å evaluere ytelsen til Abbott SARS-CoV-2-, Daan Gene-, BGI- og Sansure Biotech-analysene ved å bruke Composite Reference Standard (CRS). Studien ble utført ved Ethiopian Public Health Institute (EPHI) fra 1. til 30. desember 2020. 164 nasofaryngeale prøver ble ekstrahert ved bruk av QIAamp RNA-minisettet og Abbott DNA-prøveforberedelsessystem. Av 164 prøver var 59,1 % positive og 40,9 % negative for CRS. Sansure Biotech-positiviteten var signifikant lav sammenlignet med CRS (p < 0,05). Sansure Biotech-positiviteten var signifikant lav sammenlignet med CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotechs positive resultater var betydelig lavere sammenlignet med CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）.与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）. У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech hadde signifikant færre positive resultater sammenlignet med CRS (p < 0,05).Samlet samsvar mellom de fire analysene var 96,3–100 % sammenlignet med CRS. I tillegg til den lave positivitetsraten til Sansure Biotech-analysen, var ytelsen til de fire analysene nesten sammenlignbar. Som sådan krever Sansure Biotech [Research Only (RUO)]-analysen ytterligere validering for bruk i Etiopia. Til slutt bør ytterligere forskning vurderes for å evaluere analyser med passende produsentens påstander.
Laboratorietesting er en del av Verdens helseorganisasjons (WHO) strategiske plan for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) beredskap og respons (SPRP). WHO anbefaler at land må bygge laboratoriekapasitet for å forbedre beredskap, riktig saksbehandling, årvåkenhet og rask respons på folkehelseutfordringer. Dette antyder at laboratoriets rolle er nøkkelen til å karakterisere sykdommen og epidemiologien til nye smittestoffer og kontrollere spredningen av dem.
Diagnosen COVID-19 krever epidemiologisk og medisinsk informasjon, personlige symptomer/tegn og radiografiske og laboratoriedata2. Siden COVID-19-utbruddet ble rapportert i Wuhan, Kina, har det blitt utviklet mange kommersielle nukleinsyreamplifikasjonstester (NAAT) over hele verden. Sanntids revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (rRT-PCR) har blitt brukt som en rutine og standardmetode for laboratoriediagnostikk av alvorlig akutt respiratorisk syndrom 2 (SARS-CoV-2)3-infeksjon. Molekylær deteksjon av SARS-CoV-2 er typisk basert på N (nukleokapsidproteingenet), E (kappeproteingenet) og RdRp (RNA-avhengig RNA-polymerasegen) gener i ORF1a/b (åpen leseramme 1a/b). gen) region identifisert fra det virale genomet. De anses å være de viktigste konserverte regionene som finnes i virale genomer for virusgjenkjenning4. Blant disse genene har RdRp- og E-genene høy analytisk deteksjonssensitivitet, mens N-genet har lav analytisk sensitivitet5.
Ytelsen til PCR-analyser kan variere avhengig av ulike faktorer som: ekstraksjonsreagenser, amplifikasjons-/deteksjonsreagenser, ekstraksjonsmetode, kvaliteten på PCR-maskinen og andre instrumenter. Fra april 2020 har mer enn 48 forskjellige diagnostiske enheter fra ni land mottatt nødbruksautorisasjon (EUA) for COVID-196-diagnostikk. I Etiopia brukes mer enn 14 sanntids PCR-plattformer for PCR-deteksjon av SARS-CoV-2 ved 26 offentlige helseinstitusjoner, inkludert ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 og Quant-studio7. I tillegg er forskjellige PCR-testsett tilgjengelig, for eksempel Daan-gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test og SARS-CoV-2 BGI-test. Selv om rRT-PCR er svært sensitiv, rapporterer noen pasienter med COVID-19 falske negative resultater på grunn av utilstrekkelige kopier av viral ribonukleinsyre (RNA) i prøver på grunn av feil innsamling, transport, lagring og håndtering og laboratorietesting. forhold og handlinger til personell8. I tillegg kan feilhåndtering av prøve eller kontroll, innstilling av syklusterskel (Ct) og kryssreaktivitet med andre patogene nukleinsyrer eller inaktiv/rest SARS-CoV-2-RNA føre til falske positive resultater i rRT-PCR9-analyser. Dermed er det klart at PCR-tester faktisk kan identifisere bærere av genfragmenter, siden de ikke en gang kan skille mellom virkelig aktive virale gener, så testene kan bare identifisere bærere og ikke pasienter10. Derfor er det viktig å vurdere diagnostisk ytelse ved å bruke standardmetoder i våre omgivelser. Selv om mange NAAT-reagenser er tilgjengelige ved det etiopiske folkehelseinstituttet (EPHI) og over hele landet, er det ennå ikke rapportert noen sammenlignende evaluering av deres effektivitet. Derfor hadde denne studien som mål å evaluere den komparative ytelsen til kommersielt tilgjengelige sett for påvisning av SARS-CoV-2 ved rRT-PCR ved bruk av kliniske prøver.
Totalt 164 deltakere med mistenkt covid-19 ble inkludert i denne studien. Flertallet av prøvene var fra behandlingssentre (118/164 = 72 %), mens de resterende 46 (28 %) deltakerne var fra ikke-behandlingssentre. Blant deltakerne som ikke ble behandlet ved senteret, hadde 15 (9,1 %) klinisk mistenkte tilfeller og 31 (18,9 %) hadde kontakter med bekreftede tilfeller. Nittitre (56,7 %) deltakere var menn, og gjennomsnittsalderen (± SD) til deltakerne var 31,10 (± 11,82) år.
I denne studien ble positive og negative rater av fire tester for COVID-19 bestemt. Dermed var de positive ratene for Abbott SARS-CoV-2-analysen, Daan Gene 2019-nCoV-analysen, SARS-CoV-2 BGI-analysen og Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen henholdsvis 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % og 55,5 %. De positive og negative skårene for sammensatt referansestandard (CRS) var henholdsvis 97 (59,1 %) og 67 (40,9 %) (tabell 1). I denne studien var definisjonen av CRS basert på «enhver positiv»-regel, der av fire testresultater ble to eller flere testresultater som ga samme resultat ansett som sanne positive eller negative.
I denne studien fant vi en negativ prosentvis enighet (NPA) på 100 % (95 % KI 94,6–100) for alle analyser sammenlignet med CRS. Sansure Biotechnology-analysen viste en minimal PPA på 93,8 % (95 % KI 87,2-97,1) og Daan Gene 2019-nCoV-analysen hadde en samlet samsvar på 99,4 % (95 % KI 96,6-99,9). I motsetning til dette var den generelle samsvaret mellom SARS-CoV-2 BGI-analysen og Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen henholdsvis 98,8 % og 96,3 % (tabell 2).
Cohens kappa-koeffisient mellom CRS og Abbott SARS-CoV-2-analyseresultater var helt konsistente (K = 1,00). Tilsvarende er Cohens kappa-verdier påvist av Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI og Sansure Biotech 2019-nCoV også helt i samsvar med CRS (K ≥ 0,925). I denne komparative analysen viste kjikvadrattesten (McNemar-testen) at resultatene fra Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen var signifikant forskjellig fra CRS-resultatene (p = 0,031) (tabell 2).
Som vist i fig.1 prosentandelen av laveste Ct-verdi (< 20 Ct) av Abbott SARS-CoV-2-analysen (kombinert RdRp- og N-gen) var 87,6 % og ORF1a/b-genets Ct-verdi for Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen viste at prosentandelen av lav Ct-verdi (< 50 Ct3 % og høy Ct-verdi var < 50 Ct. Ct) var 3,2 %. 1 prosentandelen av laveste Ct-verdi (< 20 Ct) av Abbott SARS-CoV-2-analysen (kombinert RdRp- og N-gen) var 87,6 % og ORF1a/b-genets Ct-verdi for Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen viste at prosentandelen av lav Ct-verdi (< 50 Ct3 % og høy Ct-verdi var < 50 Ct. Ct) var 3,2 %.Som vist i fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6 Ct Ot 1%, г. анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3 %, а высокое значения (36 Ct) – 36 Ct. составляло 3,2 %. 1, var prosentandelen av laveste Ct-verdi (< 20 Ct)-analyse av Abbott SARS-CoV-2 (kombinert gen RdRp og N) 87,6 %, og Ct-verdien av ORF1a/b-genanalyse av Sansure Biotech 2019-nCoV viste at prosentandelen lav Ct-verdi (<, 20, Ct-verdi) (<, 20, Ct-verdi) utgjorde. (36–40 Ct) utgjorde 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比三（（< 20% Ct. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值Ct(36)的百分比为3,2 %. Som vist i figur 1 er den laveste Ct-verdiprosenten (< 20 Ct) av Abbott SARS-CoV-2-testen (kombinasjon av RdRp- og N-genet) 87,6 %, ORF1a/b-genets Ct-verdi for Sansure Biotech 2019-nCoV-testen viser lav Ct值prosent (< 50.3 %, ± 50.3 %)高Ct 值(36–40 Ct) 的-prosenten er 3,2 %. Hva er tilfellet for рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное в сентное (2 Ctчентое) размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Som vist i figur 1 hadde Abbott SARS-CoV-2-analysen (som kombinerer RdRp- og N-genene) den laveste prosentvise Ct-verdien (< 20 Ct) på 87,6 %, mens Ct-verdien til ORF1a/b-genet i Sansure Biotech 2019-studien – Analysen av nCoV viste en lav CV. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3 %, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2 %. Prosentandelen av verdier (< 20 Ct) var 50,3 %, og prosentandelen høye Ct-verdier (36–40 Ct) var 3,2 %.Abbott SARS-CoV-2 B-testen registrerte Ct-verdier over 30. På den annen side, på BGI SARS-CoV-2-analysen hadde ORF1a/b-genet en høy Ct-verdi (> 36 Ct) prosentandel var 4 % (fig. 1). På den annen side, på BGI SARS-CoV-2-analysen hadde ORF1a/b-genet en høy Ct-verdi (> 36 Ct) prosentandel var 4 % (fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого состали 1 (рисокое значение). På den annen side, i analysen av BGI SARS-CoV-2-genet hadde ORF1a/b en høy Ct-verdi (> 36 Ct), hvorav prosentandelen var 4 % (fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分毼为分毼为 På den annen side, i BGI SARS-CoV-2-deteksjon, er prosentandelen av ORF1a/b-genet med høy Ct-verdi (>36 Ct) 4 % (figur 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис.). På den annen side, i BGI SARS-CoV-2-analysen, var prosentandelen av ORF1a/b-gener med høye Ct-verdier (>36 Ct) 4 % (fig. 1).
I denne studien tok vi 164 nasofaryngeale prøver. For alle typer analyser ble RNA-isolering og amplifikasjon utført ved bruk av metodene og settene anbefalt av de respektive produsentene.
Denne studien viste at Abbotts test for SARS-CoV-2 har samme deteksjonsytelse som CRS, med 100 % positiv, negativ og generell samsvar. Cohens kappa-avtale er 1.00, noe som indikerer full avtale med CRS. En lignende studie ved University of Washington i USA fant at den generelle sensitiviteten og spesifisiteten til Abbott-testen for SARS-CoV-2 var henholdsvis 93 % og 100 % sammenlignet med den laboratoriebestemte analysen (LDA) til CDC. 11. Abbott SARS-CoV-2-deteksjonssystemet er basert på samtidig kombinert deteksjon av N- og RdRp-genene, ettersom begge genene er mer følsomme, noe som minimerer falske negativer12. En studie i Wien, Østerrike viste også at store ekstraksjonsprøvevolumer og deteksjonseluentvolumer minimerte fortynningseffekter og økte deteksjonseffektiviteten13. Dermed kan Abbotts perfekte match for SARS-CoV-2-analysen assosieres med et plattformdeteksjonssystem som samtidig oppdager kombinatoriske gener, trekker ut et stort antall prøver (0,5 ml) og bruker en stor mengde elueringsmiddel (40 µl).
Resultatene våre viste også at deteksjonsytelsen til Daan genetiske test var nesten den samme som CRS. Dette samsvarer med en studie14 utført ved Anhui University i Huainan, Kina, og produsentens påstand om 100 % positiv avtale. Til tross for rapporter om konsistente resultater, var en prøve falsk negativ etter å ha testet det samme eluatet på nytt, men var positiv i Abbott SARS-CoV-2 og Sansure Biotech nCoV-2019-analysene. Dette antyder at det kan være variasjon i resultater på tvers av ulike typer analyser. Likevel, i studien utført i Kina15, var resultatet av Daan Gene-analysen signifikant forskjellig (p < 0,05) sammenlignet med deres laboratoriedefinerte referanseanalyse. Likevel, i studien utført i Kina15, var resultatet av Daan Gene-analysen signifikant forskjellig (p < 0,05) sammenlignet med deres laboratoriedefinerte referanseanalyse. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) эталонного анализа. I en studie i Kina15 var imidlertid Daan Genes analyseresultat signifikant forskjellig (p < 0,05) fra deres laboratoriereferanseanalyse.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались в поюсра (p < 0,0сра) его эталонным лабораторным тестом. I en studie i Kina15 var imidlertid resultatene av Daans genetiske test signifikant forskjellige (p < 0,05) sammenlignet med referanselaboratorietesten.Dette avviket kan skyldes sensitiviteten til referansetesten for å oppdage SARS-CoV-2, og ytterligere studier kan være viktige for å fastslå årsaken.
I tillegg evaluerte studien vår den komparative ytelsen til SARS-CoV-2 BGI-analysen med CRS, og viste utmerket positiv prosentvis enighet (PPA = 97,9%), negativ prosentandel (NPA = 100%) og generell prosentvis enighet etter kjønn (OPA). ). = 98,8 %). Cohens Kappa-verdier viste god samsvar (K = 0,975). Studier i Nederland16 og Kina15 har vist konsistente resultater. SARS-CoV-2 BGI-testen er en enkeltgen (ORF1a/b) deteksjonstest ved bruk av 10 µl amplifikasjons-/deteksjonseluat. Til tross for god statistisk samsvar med våre referanseresultater, savnet analysen to positive prøver (1,22 %) av totalutvalget. Dette kan ha enorme kliniske implikasjoner for overføringsdynamikk både på pasient- og samfunnsnivå.
En annen sammenlignende analyse inkludert i denne studien var Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) assay; den totale matchprosenten var 96,3 %. Enighetsstyrken ble også bestemt av Cohens Kappa-verdi, som var 0,925, noe som indikerer full samsvar med CRS. Igjen er resultatene våre identiske med studier utført ved Central South University i Changsha, Kina, og ved den kliniske laboratorieavdelingen ved Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, Kina17. Selv om ovennevnte gode statistiske samsvar ble registrert, viste kjikvadrattesten (MacNemar-testen) at resultatet av Sansure Biotech-analysen har hatt en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med CRS (p < 0,005). Selv om ovennevnte gode statistiske samsvar ble registrert, viste kjikvadrattesten (MacNemar-testen) at resultatet av Sansure Biotech-analysen har hatt en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критеритерикхий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие på сравнению с CRS (p5 <). Selv om den gode statistiske overensstemmelsen ovenfor ble registrert, viste kjikvadrattesten (McNemar-testen) at resultatet av Sansure Biotech-analysen hadde en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）桨明，Sansure 看看明，Sansure Biotech相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 桨明 , san tech ，与 crs 相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。〼。。。。。。。。〉 Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макрамакне) статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech og CRS. Til tross for den gode statistiske overensstemmelsen nevnt ovenfor, viste kjikvadrattesten (McNemar-testen) en statistisk signifikant forskjell (p < 0,005) mellom Sansure Biotech-analysen og CRS.Seks prøver (3,66 %) ble funnet å være falske negative sammenlignet med CRS (tilleggstabell 1); dette er veldig viktig, spesielt gitt dynamikken i overføringen av viruset. Dataene ovenfor støtter også denne lave deteksjonsraten15.
I denne studien ble Ct-verdier bestemt for hver analyse og respektive plattform, med den laveste gjennomsnittlige Ct-verdien rapportert i Abbott SARS-CoV-2-analysen. Dette resultatet kan være relatert til Abbotts simultane kombinerte genetiske testsystem for påvisning av SARS-CoV-2. Derfor, ifølge figur 1, hadde 87,6 % av Abbott SARS-CoV-2-resultatene Ct-verdier under 20. Bare et lite antall prøveresultater (12,4 %) var i området 20-30. Ct-verdier over 30 ble ikke registrert. I tillegg til Abbotts bruk av SARS-CoV-2-panelets genetiske testformat, kan dette resultatet ha sammenheng med den nedre deteksjonsgrensen (32,5 RNA-kopier/ml)18, som er tre ganger lavere enn selskapets nedre grense på 100 RNA-kopier/mL. ml)19.
Denne studien har noen begrensninger: For det første har vi ikke standard-/referansemetoder [som virusmengde eller andre laboratorietester (LDA)] på grunn av mangel på ressurser. For det andre var alle prøvene brukt i denne studien nasofaryngeale vattpinner, mens resultatene ikke var anvendelige for andre prøvetyper, og for det tredje var prøvestørrelsen liten.
Denne studien sammenlignet ytelsen til fire rRT-PCR-analyser for SARS-CoV-2 ved bruk av nasofaryngeale prøver. Alle deteksjonsanalyser hadde nesten sammenlignbar ytelse, med unntak av Sansure Biotech-analysen. Dessuten ble den lave positivitetsraten identifisert i Sansure Biotech-analysen sammenlignet med CRS (p < 0,05). Dessuten ble den lave positivitetsraten identifisert i Sansure Biotech-analysen sammenlignet med CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). I tillegg viste Sansure Biotech-testen en lav prosentandel positive resultater sammenlignet med CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). I tillegg hadde Sansure Biotech-analysen en lavere positivitetsrate sammenlignet med CRS (p < 0,05).Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-analysen av PPA, NPA og den generelle avtalen oversteg 93,5 % med en Cohen Kappa-styrke for avtaleverdi på 0,925. Til slutt trenger Sansure Biotech Assay (RUO) ytterligere validering for bruk i Etiopia, og ytterligere forskning bør vurderes for å evaluere påstander fra individuelle produsenter.
Sammenlignende studiedesign ble utført ved fire helseinstitusjoner i Addis Abeba, Eka Kotebe sykehus, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial Hospital og St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. Dataene ble samlet inn mellom 1. og 31. desember 2020. De medisinske fasilitetene for denne studien ble målrettet valgt basert på deres høye antall tilfeller og tilgjengeligheten av store behandlingssentre i byen. På samme måte ble instrumenter, inkludert ABI 7500 og Abbott m2000 sanntids PCR-instrumenter, valgt i henhold til anbefalingene fra NAAT-reagensprodusentene, og fire PCR-deteksjonssett ble valgt for denne studien, da de fleste laboratorier i Etiopia brukte minst fire av dem. Gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test og SARS-CoV-2 BGI-test utført under studien).
Testing for SARS-CoV-2 ble utført fra 1. til 30. desember 2020 ved bruk av 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) fra individer under etterforskning for COVID-19 henvist til EPHI. Nasofaryngeale prøver ble samlet inn av trente prøvesamlere og sendt til EPHI i trippelpakninger. Før nukleinsyreisolering tildeles hver prøve et unikt identifikasjonsnummer. Ekstraksjon utføres fra hver prøve umiddelbart ved ankomst ved bruk av manuelle og automatiske ekstraksjonsmetoder. For automatisk ekstraksjon av Abbott m2000 ble 1,3 ml (inkludert 0,8 ml dødvolum og 0,5 ml ekstraksjonsinnløpsvolum) av prøven ekstrahert fra hver prøve og ført gjennom Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) En batch på 96 [92 prøver, to deteksjonskontroller og to ikke-malkontroller (NTC)] ble inkludert i den samlede prosessen (henting og deteksjon) av to runder med SARS-CoV-2 (EUA) i sanntid. gruvedrift. På samme måte, for manuell utvinning, bruk de samme prøvene (for automatisk utvinning og oppdagelse). Gjennom hele prosessen ble 140 µl prøver alikvotert og ekstrahert ved bruk av QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland) i partier på 24 (inkludert 20 prøver, to analysekontroller og to NTC-er) over ni runder. Manuelt ekstraherte eluater ble amplifisert og detektert ved bruk av en ABI 7500 termisk syklus ved bruk av SARS-CoV-2 BGI-analyse, Daan Gene-analyse og Sansure Biotech-analyse.
Automatisert isolering og rensing av SARS-CoV-2 viralt RNA følger det magnetiske perleprinsippet ved bruk av Abbott DNA-prøveprepareringsreagenser. Inaktivering av prøver og solubilisering av virale partikler utføres ved å bruke et vaskemiddel som inneholder guanidin isotiocyanat for å denaturere proteinet og inaktivere RNase. RNA separeres deretter fra proteinet ved fastfaseseparasjon ved bruk av silika, dvs. guanidiniumsaltet og den alkaliske pH-verdien i lyseringsbufferen fremmer bindingen av nukleinsyrene til silikaen (SiO2). Skylletrinnet fjerner gjenværende proteiner og rusk for å produsere en klar løsning. Transparent RNA er isolert fra silikabaserte mikropartikler ved hjelp av instrumentets magnetfelt20,21. På den annen side utføres manuell isolering og rensing av RNA ved spinnkolonnemetoden ved bruk av sentrifugering i stedet for et magnetisk stativ og separasjon av mikropartikler fra eluenten.
Abbott sanntids SARS-CoV-2-deteksjonstest (Abbott Molecular, Inc.) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner, som mottok EUA19,22 fra WHO og FDA. I denne protokollen ble prøveinaktivering før ekstraksjon utført i et vannbad ved 56 ° C i 30 minutter. Etter virusinaktivering ble nukleinsyreekstraksjon utført på et Abbott m2000 SP-instrument fra 0,5 ml VTM ved bruk av et Abbott m2000 DNA-prøveprepareringssystem. ifølge produsenten. Amplifikasjon og deteksjon ble utført ved bruk av et Abbott m2000 RT-PCR-instrument, og dobbel deteksjon ble utført for RdRp- og N-genene. ROX) og VIC P (proprietært fargestoff) for målretting og deteksjon av interne kontroller, som tillater samtidig deteksjon av begge amplifikasjonsproduktene 19 .
Amplifikasjonsdeteksjonsmetoden til dette settet er basert på ett-trinns RT-PCR-teknologi. ORF1a/b- og N-genene ble valgt som konserverte regioner av Daan Gene Technology for å oppdage målregionamplifikasjon. Spesifikke primere og fluorescerende prober (N-genprober merket med FAM, ORF1a/b-prober merket med VIC) er designet for å oppdage SARS-CoV-2 RNA i prøver. Den endelige eluerings- og masterblandingen ble tilberedt ved å tilsette 5 ul elueringsmiddel til 20 ul av masterblandingen til et sluttvolum på 25 ul. Amplifikasjon og deteksjon ble utført samtidig på et ABI 750024 sanntids PCR-instrument.
ORF1a/b- og N-genene ble påvist ved bruk av Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluorescerende PCR-deteksjon). Forbered spesifikke prober for hvert målgen ved å velge FAM-kanalen for ORF1a/b-regionen og ROX-kanalen for N-genet. Til dette analysesettet tilsettes elueringsmiddel og mastermixreagenser som følger: klargjør 30 µl mastermix-reagens og 20 µl eluert prøve for deteksjon/amplifisering. Sanntids PCR ABI 750025 ble brukt for amplifikasjon/deteksjon.
SARS-CoV-2 BGI-testen er et fluorescerende sanntids rRT-PCR-sett for diagnose av COVID-19. Målregionen er lokalisert i ORF1a/b-regionen av SARS-CoV-2-genomet, som er en enkelt gendeteksjonsmetode. I tillegg er det humane husholdningsgenet β-aktin et internt regulert målgen. Masterblandingen tilberedes ved å blande 20 µl av mastermix-reagensen og 10 µl av den ekstraherte RNA-prøven i en brønnplate26. Et ABI 7500 fluorescerende kvantitativ sanntids PCR-instrument ble brukt for amplifikasjon og deteksjon. All nukleinsyreamplifikasjon, PCR-kjøringsbetingelser for hver analyse og tolkning av resultater ble utført i henhold til den respektive produsentens instruksjoner (tabell 3).
I denne komparative analysen brukte vi ikke referansestandardmetoden for å bestemme prosentvis samsvar (positiv, negativ og samlet) og andre sammenligningsparametere for de fire analysene. Hver testsammenligning ble gjort med CRS, i denne studien ble CRS satt av regelen "alle positive" og resultatet ble bestemt, ikke ved en enkelt test, vi brukte minst to matchede testresultater. I tillegg, i tilfelle av overføring av covid-19, er falske negative resultater farligere enn falske positive resultater. Derfor, for å si "positiv" så nøyaktig som mulig fra et CRS-resultat, må minst to analysetester være positive, noe som betyr at minst ett positivt resultat sannsynligvis kommer fra en EUA-analyse. Av fire testresultater regnes således to eller flere testresultater som gir samme resultat som sanne positive eller negative18,27.
Data ble samlet inn ved hjelp av strukturerte dataekstraksjonsskjemaer, dataregistrering og analyse ble utført ved bruk av Excel statistisk programvare og SPSS versjon 23.0 for beskrivende statistikk. Positiv, negativ og total prosent samsvar ble analysert, og en Kappa-score ble brukt for å bestemme graden av samsvar for hver metode med CRS. Kappa-verdier tolkes som følger: 0,01 til 0,20 for mild enighet, 0,21 til 0,40 for generell enighet, 0,41-0,60 for moderat enighet, 0,61-0,80 for større enighet og 0,81-0,99 for fullstendig enighet28.
Etisk godkjenning ble innhentet fra University of Addis Abeba og alle eksperimentelle protokoller for denne studien ble godkjent av Ethiopian Public Health Institutes Scientific Ethics Review Board. Referansenummeret for EPHI Ethics License er EPHI/IRB-279-2020. Alle metodene ble brukt i samsvar med anbefalingene og bestemmelsene i de etiopiske nasjonale omfattende retningslinjene for behandling av COVID-19. I tillegg ble det innhentet skriftlig informert samtykke fra alle studiedeltakerne før deltagelse i studien.
Alle data innhentet eller analysert i denne studien er inkludert i denne publiserte artikkelen. Data som støtter resultatene av denne studien er tilgjengelig fra den respektive forfatteren på rimelig forespørsel.
Verdens helseorganisasjon. Anbefalinger for laboratorieteststrategier for COVID-19: Midlertidig veiledning, 21. mars 2020 nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 smart diagnose i akuttmottaket: All-in i praksis. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 smart diagnose i akuttmottaket: All-in i praksis.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. og Gurgulianis, KI Intelligent diagnose av COVID-19 i akuttmottaket: alt i praksis.Muliou DS, Pantazopoulos I. og Gurgulyanis KI Intelligent diagnose av COVID-19 i akuttmottak: ende-til-ende integrasjon i praksis. Ekspert pastor Respire. medisin. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Evaluering av COVID19 ID NOW EUA-analysen. Mitchell, SL & St George, K. Evaluering av COVID19 ID NOW EUA-analysen.Mitchell, SL og St. George, K. Evaluering av COVID19 ID NOW EUA-analysen.Mitchell SL og St. George K. Evaluering av COVID19 ID NOW EUA-analysen. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratoriepåvisning av koronavirussykdom 2019 (COVID-19) ved mistenkt sykdom hos mennesker. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (åpnet 15. august 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al. COVID-19-diagnose: sykdommer og testverktøy. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Etablering av College of Pathologists of Eastern, Central and Southern Africa – Regional School of Pathology of the Middle East and South Africa. Afrika. J. Lab. medisin. 9(1), 1–8 (2020).
Etiopisk folkehelseinstitutt, det føderale helsedepartementet. Midlertidig nasjonal strategi og veiledning for laboratoriediagnose av COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (søkt 12. august 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falsk negative tester for SARS-CoV-2-infeksjonsutfordringer og implikasjoner. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falsk negative tester for SARS-CoV-2-infeksjonsutfordringer og implikasjoner.Voloshin S., Patel N. og Kesselheim AS Falsk-negative tester for SARS-CoV-2-infeksjoner og deres konsekvenser.Voloshin S., Patel N. og Kesselheim AS Falsk-negative tester for provokasjon og virkningen av SARS-CoV-2-infeksjon. N. eng. J. Medisin. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falsk-positive og falsk-negative COVID-19-tilfeller: Respiratorisk forebygging og håndteringsstrategier, vaksinasjon og ytterligere perspektiver. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falsk-positive og falsk-negative COVID-19-tilfeller: Respiratorisk forebygging og håndteringsstrategier, vaksinasjon og ytterligere perspektiver. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI. вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falske positive og falske negative tilfeller av COVID-19: respiratorisk forebygging og behandlingsstrategier, vaksinasjon og veien videre.Muliu, DS og Gurgulianis, KI Falsk-positive og falsk-negative tilfeller av COVID-19: strategier for respiratorisk forebygging og behandling, vaksinasjon og veien videre. Ekspert pastor Respire. medisin. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnose i akuttmottaket: Ser treet, men mister skogen. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnose i akuttmottaket: Ser treet, men mister skogen.Mouliou, DS, Ioannis, P. og Konstantinos, G. COVID-19-diagnose i akuttmottaket: Se treet, miste skogen.Muliou DS, Ioannis P. og Konstantinos G. COVID-19-diagnose på legevakter: Ikke nok skog for trærne. vises. medisin. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validering og validering av den analytiske og kliniske ytelsen til Abbott RealTime SARS-CoV-2-analysen. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning av fem primersett fra forskjellige genomregioner av COVID-19 for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning av fem primersett fra forskjellige genomregioner av COVID-19 for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. og Aflatunyan, B. Sammenligning av fem sett med primere fra forskjellige regioner av COVID-19-genomet for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning av 5 forskjellige genetiske regioner av COVID-19 for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. og Aflatunyan B. Sammenligning av fem sett med primere fra forskjellige regioner av COVID-19-genomet for påvisning av virusinfeksjon ved konvensjonell RT-PCR.Iran. J. Microbiology. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Foreløpige resultater av det nasjonale eksterne kvalitetsvurderingsprogrammet for påvisning av SARS-CoV-2 genomsekvenser. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Analytisk evaluering av effekten av fem RT-PCR-sett for alvorlig akutt respiratorisk syndrom Coronavirus 2. J. Clinical. laboratorium. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Evaluering av syv kommersielt tilgjengelige SARS-CoV-2 RNA-deteksjonssett i Kina basert på sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR). klinisk. Kjemisk. laboratorium. medisin. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Sammenligning av syv kommersielle RT-PCR COVID-19 diagnosesett. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Sammenligning av diagnostisk ytelse av to PCR-sett for påvisning av SARS-CoV-2-nukleinsyrer. J. Clinical. laboratorium. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. En sammenlignende studie av fire SARS-CoV-2 nukleinsyreamplifikasjonstesting (NAAT)-plattformer viste at ID NOW-ytelsen ble betydelig forringet avhengig av pasient og prøvetype. diagnose. mikrobiologi. Infisere. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbott molekyl. Abbott sanntids SARS-CoV-2-analysepakkevedlegg. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Fra og med 10. august 2020) (2020).
Klein, S. et al. SARS-CoV-2 RNA-isolasjon ved bruk av magnetiske perler for rask storskala deteksjon ved RT-qPCR og RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).